给大家一份自然基金本子
（一）立项依据与研究内容（4000-8000字）：
1. 项目的立项依据（研究意义、国内外研究现状及分析，附主要参考文献目录。）
血吸虫病是热带亚热带发展中国家的严重寄生虫病。据世界卫生组织（WHO）报道，该病在全世界74个国家中流行，6亿多人口受到威胁，2亿多人受到感染，其中1.2亿伴有临床症状，2000万伴有严重后遗症；全世界每年死于血吸虫病性肝纤维化及其并发症的患者达50万-100万；血吸虫病在14岁以下的儿童中发病率之高，严重影响了儿童的智力发育和身心健康[1]。现已发现有6种血吸虫引起人类疾病，我国是日本血吸虫病流行最严重的国家[2]。该病主要分布于我国长江流域及其南部的12个省（区、市），受威胁的人群达1亿以上，感染人数超过1000万[2]。目前，我国日本血吸虫病的流行尚未得到有效控制，湖区患病人数急剧增加。该病已成为严重影响我国人民身心健康和国民经济、社会发展和稳定的主要疾病之一[2]。
血吸虫病是一种虫卵肉芽肿引起的慢性免疫性疾病，其病理基础是沉积于组织内大量的成熟虫卵对机体的刺激、宿主对活毛蚴分泌的可溶性抗原产生的病理性免疫应答，并形成虫卵肉芽肿和继发肝纤维化的形成[2]。肝纤维化是血吸虫病严重的后果，它可进一步导致门静脉高压症如食管胃底静脉曲张、脾肿大和脾功能亢进，最后引发上消化道大出血导致死亡[2]。日本血吸虫病肝纤维化/肝硬化及其并发症是血吸虫病患者死亡的主要原因[3]。根据以上的发病机理和病理进程，针对日本血吸虫病的治疗应包括杀虫，抑制虫卵肉芽肿，减轻、延缓甚至阻止纤维化形成等三个关键环节。目前国内外治疗血吸虫病主要采用杀虫疗法（即第一环节），尤其是首选吡喹酮为抗血吸虫病药物[2, 4]，因此，这就产生了以下问题：第一，吡喹酮只对童虫、成虫和组织内成熟虫卵具有杀灭作用，所以，杀虫治疗后肝脏及肠壁组织内未成熟虫卵仍可继续发育，组织虫卵肉芽肿反应仍在继续[5, 6]；第二，由于慢性患者（此类患者在血吸虫感染者中占大多数）临床上多无症状或只表现为慢性腹泻而易延误诊断[2]，结果往往不能及时使用杀虫药，导致肝肉芽肿和纤维化的形成；第三，近年国外已从经有效剂量吡喹酮治疗曼氏血吸虫病未愈的感染者中分离出抗药株[7]。由于药物压力，日本血吸虫同样存在抗药株产生的可能性；第四，对于已形成的虫卵或纤维化，杀虫疗法也无能为力[4]；此外，有报道，日本血吸虫病患者在彻底杀虫治疗后肝纤维化仍可继续发展[8, 9]。因此，杀虫治疗后，使用针对肉芽肿免疫调节和抗纤维化的药物治疗显得更加迫切。但因为目前对虫卵肉芽肿形成以及由此引起纤维化的机制了解很少，所以，尚未成功研发出针对这两个环节、疗效确切、副作用少的化学药物[2, 4]。研究虫卵肉芽肿形成以及由其引起纤维化的机制，研发疗效明确、副作用少，能直接抑制血吸虫虫卵肉芽肿形成、减轻或延缓纤维化的药物对降低血吸虫病发病率、提高生存质量、治疗病人、降低死亡率都具有十分重要的意义。
日本血吸虫虫卵肉芽肿的形成与细胞及体液免疫有关，尤其是前者在肉芽肿形成早期起主要作用[2]。血吸虫尾蚴通过疫水经皮肤感染人体，先后经过童虫、成虫阶段，最后主要移行于肝门静脉和肠系膜静脉并寄生、产卵。虫卵随血流主要沉积于门静脉分支、肝血窦前，在此，虫卵内成熟的毛蚴分泌可溶性虫卵抗原（soluble egg antigen,SEA）并经卵壳上的微孔渗入肝周围组织。SEA被周围组织中的巨噬细胞吞噬处理，经过处理的抗原被递呈到辅助性的T淋巴细胞（Th）。同时，摄取了抗原的巨噬细胞释放白细胞介素1（IL-1），激活TH，后者产生多种细胞因子，其中促进肉芽肿形成的有IL-1、IL-2 、IL-4 、IL-5、IL-13等；抑制肉芽肿形成的有IL-10、IL-2、IFN-γ等；还有各类细胞趋化因子、移动抑制因子等。在上述各种细胞因子的共同参与下，大量巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、浆细胞、成纤维细胞和嗜酸粒细胞等聚集到虫卵周围形成炎性肉芽肿，随后肉芽肿中心坏死，形成嗜酸性脓肿，卵内毛蚴逐渐死亡，SEA分泌量减少，最终停止，肉芽肿退化并开始局部纤维化，由此可引出严重临床症状[2, 4]。在这些细胞因子中，IL-4、IFN-γ在日本血吸虫肉芽肿的形成和发展中起重要作用[2, 10]。IL-4由Th2细胞产生，能促进Th2细胞自身的增殖、分化并刺激自身和其它Th2细胞分泌IL-5，而IL-5通过刺激嗜酸粒细胞（EOS）增殖、分化而促进肉芽肿的炎性反应；IL-4能诱导单核细胞分泌克隆刺激因子、促进巨噬细胞分化、促进淋巴细胞侵润而增强肉芽肿炎性反应； IL-4通过刺激B淋巴细胞增殖分化并产生IgE、IgG，而介导肉芽肿形成；此外，IL-4可抑制Th1细胞增殖，并下调Th1细胞在肉芽肿炎性反应中的作用。IFN-γ由Th1细胞产生，能抑制Th2细胞增殖和IL-4、IL-5产生，从而减轻肉芽肿炎症，此外IFN-γ还抑制Ⅰ、Ⅱ型胶原转录而减轻纤维化等。总之，在血吸虫感染早期，肉芽肿形成过程中，多种细胞因子均有增加，它们之间相互作用形成一个及其复杂的网络。这些细胞因子的综合作用调控着肉芽肿形成及以后纤维化的发生、发展。下调促进肉芽肿形成细胞因子和/或上调抑制肉芽肿形成细胞因子的表达，是控制肉芽肿形成的一个理想途径。
虽然目前对于血吸虫性肝纤维化的发生机制尚不清楚，但国际上对非血吸虫病性肝纤维化的发生机理研究较多，也较明确。肝纤维化是指肝脏纤维组织过度沉积，是纤维增生和分解不平衡的结果。反复或持续的慢性肝实质炎症、坏死，可使细胞外基质（extracellular matrix, ECM），主要为胶原纤维，合成过多而降解相对不足，从而形成肝纤维化，它是肝硬化的必经阶段[4]。肝星状细胞（hepatic stellate cell, HSC）目前被公认为是ECM的主要来源细胞，HSC的激活是肝纤维化形成初始的中心环节[4, 11]。所以，研究HSC的激活对探索血吸虫病肝纤维化发生机理及肝纤维化的有效预防均有特别重要的现实意义。
HSC的激活是一个级联反应过程，其过程如下[4, 12]：当肝脏受到各种损伤时，局部的肝细胞、枯否细胞（巨噬细胞）、窦内皮细胞、血小板、淋巴细胞、中性粒细胞等释放多种细胞因子，其中最主要的是血小板源性生长因子（platel et-derived growth factor, PDGF）和转化生长因子β（transforming growth factor-β1 ,TGFβ1）等，它们共同作用于HSC，使其激活。被激活的HSC向肌成纤维细胞（myofibroblast，MFB）转化，同时表达大量的平滑肌肌动蛋白（α-Smooth muscle actin,α-SMA）、多种细胞因子受体（例如PDGF受体和TGFβ1受体等）、以及Ⅰ、Ⅲ型胶原等ECM成分；并且被激活的HSC自身又激活κ基因结合核因子（nuclear factor-κ-gene-binding, NFκB）、分泌TGFβ1等细胞因子。此外，ECM中的Ⅰ型胶原等成分也可激活HSC。因此，一旦HSC被激活，受细胞旁分泌、自分泌的直接作用及所处环境胶原的间接作用，HSC活化将逐渐放大并持续存在，即使除去诱因，活化也将继续下去[4]。
HSC的激活主要是因为某些细胞因子作用于该细胞的信号转导通路所致，在这些细胞因子中，研究的最多，也最重要的是PDGF和 TGFβ1[4, 13, 14]因子。
PDGF为HSC最强的促分裂剂[4]。枯否细胞（巨噬细胞）是主要合成PDGF的细胞。肝脏受损时，枯否细胞、血小板、窦内皮细胞及激活的HSC均可以分泌PDGF[4]。当其与PDGF受体（为酪氨酸蛋白激酶受体）结合时，促使受体形成二聚体而被激活，随后受体的酪氨酸残基发生自身磷酸化，继而先后激活Ras、Raf-1、MAPK(mitogen-activated protein kinase)激酶、ERK（extracellular signal-regulated kinase）。ERK向核内转位，促进有关转录因子磷酸化及基因表达而引起HSC的活化、增殖[4]。
TGFβ1是一种对细胞生长、分化和多种生理、病理过程起重要调节作用的细胞因子。在肝受损时，TGFβ1由枯否细胞、淋巴细胞、窦内皮细胞及激活的HSC等合成，能促进HSC的增殖和基因表达、抑制基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases， MMPs）合成、促进基质金属蛋白酶组织抑制因子（tissue inhibitors of MMPs, TIMPs）合成、阻滞ECM的降解、促进ECM（例如，Ⅰ、Ⅲ型胶原）的生成。此外，TGFβ1还能增加PDGF对HSC的增殖作用，故TGFβ1被认为是最强的促胶原生成因子，在肝纤维化的发生、发展过程中发挥关键作用[4, 13]。TGFβ1通过细胞内信号转导通路发挥作用，而Smads是迄今为止发现的TGFβ1惟一作用底物[4]，故TGFβ1-Smads信号通路对HSC激活、ECM产生的影响引起极大关注。
Smads是线虫Sma蛋白以及果蝇Mad蛋白具有同源性的蛋白家族，他们可以将TGFβ1信号直接由细胞膜受体（为丝/苏氨酸受体）传导入细胞核内。根据Smads功能不同分为三类：第一类是膜受体激活的Smad (R-Smads)，包括Smad2、3等，它们可与TGFβ1受体直接作用，并被磷酸化，之后与Smad4结合，转位入核以调节靶基因转录；第二类是通用Smad (co-Smad)，目前只有Smad4；第三类是Smad7等，为TGFβ1-Smad信号转导通路的抑制因子，可与R-Smads竞争性地结合受体，阻止R-Smads的磷酸化，从而阻断TGFβ1的效应。 进入细胞核内的 Smads复合物可与不同的转录活化因子或转录抑制因子结合而调节TGFβ1的生物效应[4, 13]。
总之，因为PDGF、TGFβ1-Smad信号转导通路在肝纤维化发病中起着举足轻重的作用，干预这些信号通路就成为肝纤维化防治的理想选择。
如前所述，HSC活化时伴有NFκB激活，而NFκB是一种重要的抗凋亡基因转录因子[15, 16]。当HSC处于静息状态时，NFκB与其抑制蛋白结合，不表现活性，当HSC被激活后，NFκB与其抑制蛋白解离而移位入核，诱导产生一组基因产物，它们的协同作用能抑制TNF-α诱发的caspase-8激活从而抑制HSC的凋亡，使HSC持续活化[17, 18]。
此外，B细胞淋巴瘤/白血病-2蛋白（B-cell lymphoma/leukemia-2protein，Bcl-2）家族的成员是细胞凋亡的主要调节因子[19]。Bcl-2蛋白家族细胞凋亡抑制因子有:Bcl-2、Bcl-XL等；细胞凋亡促进因子有:Bax等。有实验显示[20]，给予抗肝纤维化的药物，可以使激活的HSC中的Bcl-2/Bax比率下调，从而促进HSC凋亡。所以，通过抑制NF-κB活性以及下调Bcl-2/Bax比率来增加HSC凋亡,可能成为肝纤维化治疗的新的靶点之一。
HSC活化后还表达多种MMPs、TIMPs，从而调节ECM的成分和含量，使纤维化不断持续发展。MMPs是一组锌蛋白酶，共有5类不同的酶蛋白分子，包括胶原酶（MMP1、MMP8、MMP13）、明胶酶（MMP2、MMP9）、基质分解素（MMP3、MMP10、MMP11）等5类，它们能水解ECM中的多种成分，例如，其中的胶原酶水解ECM中的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原；TIMPs是MMPs天然的体内抑制因子，包括TIMP-1～TIMP-4，它们与活化的MMPs分子以1∶1的比例结合，抑制MMPs活性[4]，尤其是TIMP-1在调节胶原水解中起重要作用[21]。此外，TIMP-1还能抑制活化的HSC凋亡[22]。显然，通过抑制TIMP-1即可以增加ECM中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原的水解，又可以促进HSC凋亡。所以，抑制TIMP-1将可能成为肝纤维化治疗的又一新的靶点。
以上主要是关于血吸虫虫卵肉芽肿与细胞因子免疫调节的关系，以及非血吸虫病性肝纤维化发生的机理。但血吸虫病（尤其是日本血吸虫病）性肝纤维化发生机理如何，至今知之甚少。例如，虫卵肉芽肿早期淋巴细胞、枯否细胞（巨噬细胞）、嗜酸粒细胞等分泌的细胞因子是否作为始动因子促进后续的肝纤维化的进程？是否也存在HSC的激活、增殖？从整体、细胞、蛋白质、和核酸分子水平上了解日本血吸虫病肝纤维化的发生机理是本项目研究内容之一。
中医认为，肝纤维化主要因“气滞血瘀”所致，治疗上应以活血化瘀、疏肝理气、抗炎保肝为主[4]。而赤芍具有活血化瘀功效，白芍具有养血保肝、抗炎止痛等作用[23, 24]，所以，临床治疗肝纤维化中药方剂中，有不少含有赤芍、白芍成分[4]。我们近年来研究发现，白芍总苷（为白芍的有效部位，其中芍药苷含量占70%以上）通过清除自由基及减少TGFβ1的生成，对抗人白蛋白所致的免疫性大鼠肝纤维化；此外，白芍总苷可以明显抑制佐剂性关节炎大鼠膝关节巨噬细胞样滑膜细胞的IL-1分泌，并且抑制成纤维样滑膜细胞内MAPK信号通路中ERK等的磷酸化、减弱成纤维样滑膜细胞的增殖。总之，白芍总苷通过对T细胞、B细胞、巨噬细胞、滑膜成纤维细胞以及自由基、IL-1 、IL-2等的影响而发挥其抗炎、保肝、抗肝纤维化、以及双相免疫调节等作用。
赤芍（Radix Paeoniae Rubra）和白芍（Radix Paeoniae Alba）均取材于中药芍药（Paeonia lactiflora Pall.）根[23]。芍药苷（paeoniflorin）是芍药根的提取物，也是白芍和赤芍的主要活性单体成分[24]。芍药苷分子结构式为：
其分子式为：C23H28O11 ；分子量为：480.45；熔点：196℃，毒性极低，具有抗炎[25, 26]、抑制血小板凝聚、镇痛[26]、抗过敏[25]、免疫调节[27]等作用。有报道，芍药苷通过诱导某些淋巴细胞凋亡、改变淋巴细胞亚群分布来发挥其抗炎及免疫调节等作用[28]；此外，芍药苷还通过保护肝细胞，同时抑制肝细胞分泌Ⅳ型胶原等ECM成分来发挥抗肝纤维化作用[29]。但芍药苷在虫卵肉芽肿形成的早期，如何通过免疫调节作用，抑制或降低炎性反应的强度；而在肝纤维化形成的早期，又如何干预HSC的信号转导、影响HSC的凋亡，减轻或延缓纤维化的形成，国内外尚未见报道。研究药物在这些方面的作用机制，对于减轻血吸虫病的肝脏损害，抑制杀虫治疗后肝脏持续纤维化过程，具有十分重要的意义。所以，研究中药芍药苷对虫卵肉芽肿炎性反应的影响，及其对肝纤维化的作用机制是本项目研究内容之二。
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2、项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键问题。（此部分为重点阐述内容）
（1）研究内容：本项目以芍药苷作用于日本血吸虫病肝脏肉芽肿小鼠模型，主要研究内容为：
① 制备ICR株小鼠日本血吸虫病肝虫卵肉芽肿和肝脏纤维化模型；观察药物治疗前后小鼠肝组织大体以及光、电镜下肉芽肿和肝纤维化的形态学改变；肝组织虫卵计数、肝虫卵肉芽肿大小及数量检测；肉芽肿内嗜酸性粒细胞计数；肝纤维化染色及纤维化程度判断；HSC观察；细胞凋亡小体观察；
② 用免疫组织化学法检测芍药苷治疗前后肝组织中IL-4、IFN-γ、TGFβ1及其受体、PDGF及其受体、NFκB、Bcl-2、Bax 、MMP13、TIMP1表达情况；
③ 肝组织HSC分离、培养；用流式细胞术检测小鼠HSC凋亡；检测小鼠HSC中的Smad3、Smad7以及ERK表达；用RT-PCR法检测芍药苷治疗前后小鼠HSC中Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达情况；
通过上述实验观察和检测，围绕虫卵肉芽肿形成、HSC激活、凋亡和胶原产生的过程，探讨芍药苷对血吸虫虫卵肉芽肿以及肝纤维化的作用机制。
（2）研究目标：
① 探讨细胞因子对日本血吸虫虫卵肉芽肿免疫调节作用；
② 阐明肝纤维化过程中参与纤维化形成的HSC信号转导的分子机制；
③ 研究芍药苷对虫卵肉芽肿炎性反应的免疫调节；
④ 研究芍药苷对肝纤维化细胞信号转导的干预。
(3) 拟解决的关键问题:
本项目通过芍药苷对小鼠血吸虫虫卵肉芽肿炎性细胞因子网络调节，对肝纤维化中HSC激活、凋亡信号通路中的信号分子、凋亡因子的作用，以及对MMPs、TIMPs、Ⅰ、Ⅲ型胶原表达的影响，从而阐明芍药苷对虫卵肉芽肿及肝纤维化的作用机制，为研发抗血吸虫肉芽肿及抗血吸虫病肝纤维化新药提供理论和实验根据。
3、拟采取的研究方案及可行性分析。（包括有关方法、技术路线、实验手段、关键技术等说明）
研究方案：
（1）健康ICR株小鼠600只，雌雄各半，随机分成6组：正常对照组、模型对照组、生理盐水组、低剂量药物组、中剂量药物组、高剂量药物组，每组100只。除正常对照组以外，其余各组均被制成血吸虫病肝纤维化模型；
（2）制作ICR株小鼠血吸虫病肝纤维化模型：以日本血吸虫尾蚴40±5条经腹部皮肤感染小鼠，常规饮食于并感染后第4周给药，第6、7、8、12、16周从每组中随机捉拿20只小鼠，其中10只立即处死，称量肝脏，留取肝组织标本待测，另10只作肝组织的分离、培养；
（3）镜下观察上述各组小鼠肝组织形态学改变：
① 取1克肝组织，常规固定、石蜡切片、HE染色，在普通光镜下观察肝的病理组织学改变情况并摄片；取1㎜3大小肝组织，固定、脱水、包埋、烤干、切片，在透射电镜下观察并摄片（注意观察凋亡小体的形态及数量）；
② 虫卵肉芽肿大小、数量检测：以此作为肉芽肿炎性反应程度的一个指标。取1克肝组织，10%甲醛固定，石蜡包埋，切片厚约4～5μm，HE染色。应用医学图像分析系统测量切片中所有含完整毛蚴的单虫卵肉芽肿面积，用标准计算纸测量肝组织面积，全部数据输入计算机，计算以下指标：a.虫卵肉芽肿大小：包括虫卵肉芽肿截面面积（mm2/个）和体积(mm3/个)；b.虫卵肉芽肿数量：即单位面积肝组织内虫卵肉芽肿的数量（个/cm2）；
③ 肝组织虫卵计数：以此作为小鼠感染程度的一个指标。称取肝组织1g，剪碎，置于小烧杯中，加入50g/L的KOH 10ml，于37℃孵箱中消化12 h（过夜），直至组织消化完全，搅匀，吸取100μl，涂片4张，加盖玻片在显微镜下计数全部4张涂片虫卵数，再乘以100，即为虫卵数/g肝组织(EPG)。以EPG值乘以每只小鼠的肝脏重量，即为肝脏虫卵总数；
④ 在普通显微镜下对肉芽肿内嗜酸性粒细胞进行计数，并计算各组均值，以此作为肉芽肿炎性反应程度的另一个指标；
⑤ 用免疫组织化学法(PicTure二步法)检测肝组织中IL-4、IFN-γ、TGFβ1及其受体、PDGF及其受体、NFκB(p65)、Bcl-2、Bax 、MMP13、TIMP1表达情况。每批实验均设立阴、阳性对照。采用MetaMorph显微图象分析系统对图象定量分析。
⑥ 用免疫组织化学法检测激活的HSC：肝组织切片在室温下与抗α-SMA单抗对切片孵育30分钟后，再与抗鼠IgG2a-过氧化物酶结合物反应，用DAB显色、苏木精、伊红复染。光镜下激活的HSC呈棕褐色。用MetaMorph显微图象分析系统对图象进行定量分析，了解HSC被激活的情况；
⑦ 用Van Gieson苦味酸-酸性品红法对肝组织切片进行染色，胶原纤维呈红色，肌纤维、胞浆和红细胞呈黄色，细胞核呈蓝黑色。用MetaMorph显微图象分析系统进行定量分析，以此来判断、比较肝纤维化程度；
（4）分离、培养肝组织中的HSC：小鼠在给予麻醉、抗凝后，无菌下以16号套管针作门静脉插管，灌注D-Hanks液至肝脏充盈，剪开下腔静脉放血后结扎。用另一个16号套管作上腔静脉插管，形成门静脉-上腔静脉循环。分别以0.1%链霉蛋白酶E、0.03%Ⅰ型胶原酶灌注3～4分钟后取出肝脏、剪碎，用链霉蛋白酶E、DNA酶消化后，200目筛网过滤、Percoll密度梯度离心、无血清RPMI1640培养液培养。在光镜下培养原代肝星状细胞呈星形或多边形，胞浆丰富，内含脂滴而激活的肝星状细胞脂滴减少或消失，有的细胞变成梭形。用台盼蓝排斥实验检测HSC活力；
（5）用流式细胞仪检测各组HSC的DNA含量，分析细胞凋亡指数，了解药物对HSC凋亡的影响；
（6）用Western blot 法分别检测HSC中Smad3、7和 ERK的含量（采用凝胶成像系统扫描，以特异性条带浓度与面积的乘积为有效值，反映蛋白表达水平），以了解虫卵肉芽肿及药物对HSC信号转导通路中蛋白激酶的影响；
（7）提取HSC中的总mRNA，用RT-PCR法分别检测HSC中的Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA的表达，以了解肝纤维化时药物对Ⅰ、Ⅲ型胶原的影响；
可行性分析：
血吸虫病肝肉芽肿及纤维化模型已成为常规实验模型；本室已掌握肝星状细胞的分离培养技术；已完成国家自然基金血吸虫细胞信号转导的研究；本实验室具有完备、先进的实验仪器和设备（见“工作条件”）；课题组人员配备合理、并掌握了分子生物学、免疫学及细胞生物学有关实验技术；本课题组已完成白芍总苷对实验性关节炎的滑膜细胞信号转导的影响的研究，并对白芍总苷进行了抗炎、免疫调节等研究。
附实验流程图：
4、本项目的特色与创新之处。
（1） 探讨芍药苷对血吸虫虫卵肉芽肿的免疫调节和早期肝纤维化细胞信号转导的干预，为血吸虫性肝病治疗寻找新的药物和靶点；选择继“杀虫治疗”之后“抗病治疗”的新型药物。探讨中药有效成分对血吸虫虫卵肉芽肿及肝纤维化的治疗作用，此项研究国内外未见报道。
（2） 探讨细胞因子及HSC内信号转导的主要激酶在血吸虫病肝纤维化中的作用；
（3） 从肝纤维化中起决定作用的HSC及炎性反应和早期纤维化的形成着手，探讨血吸虫病肝纤维化的发生机理。
5、年度研究计划及预期研究结果。（包括拟组织的重要学术交流活动、国际合作与交流计划等）
（1）2006年1月-6月：制作血吸虫病肝纤维化小鼠模型；预实验；光镜、电镜观察；
（2）2006年7月-12月： 免疫组化，流式细胞术检测
（3）2007年1月-6月: 肝星状细胞分离、培养；
（4） 2007年7-12月：细胞因子检测；实验检测、收集数据、统计分析；
（5）2008年1月-6月：HSC凋亡检测，肝脏纤维化相关细胞信号转导通路因子检测；（6）2008年7月-12月：结题；撰写论文并在SCI期刊上发表4-5篇论著。
（二）研究基础与工作条件
1、 工作基础（与本项目相关的研究工作积累和已取得的研究工作成绩）
（1）本室掌握了杂交瘤细胞技术、免疫组化、体液与细胞免疫、PCR技术、基因克隆、蛋白质原核及真核表达、蛋白质分析等相关的技术方法；
（2）本室掌握了小鼠血吸虫病肝肉芽肿及纤维化模型的制作方法；
（3）本室熟悉小鼠肝星状细胞分离、培养技术；
（4）本室掌握了医学统计分析方法及相关软件的应用；
（5）本室已进行了白芍总苷对佐剂性关节炎大鼠治疗作用的研究，实验证明：
①白芍总苷可明显减轻大鼠的足爪肿胀度及全身继发性关节病变；有效减缓大鼠体重减轻及关节病理变化，如减轻滑膜增生，减少淋巴细胞侵润等；
②白芍总苷可纠正关节滑膜细胞的增殖和分泌功能；抑制滑膜细胞内的ERK、JNK、P38磷酸化程度；对滑膜细胞内的基质金属蛋白酶表达也有一定的调节作用；
③白芍总苷可纠正关节滑膜细胞内G蛋白偶联信号通路的紊乱；抑制IL-1a的作用；
（6）本室已进行了白芍总苷对小鼠免疫性肝纤维化治疗作用的研究，并于今年在《World Journal of Gastroenterology》上将发表相关研究成果（Therapeutic effects of total glucosides of paeony on rats with immunological hepatic fibrosis. in press ）,该研究表明白芍总苷可以减缓小鼠免疫性肝纤维化；
（7）本室还对白芍总苷进行了抗炎、免疫调节、抗氧化等一系列药理作用的研究，以及白芍总苷对细胞内某些信号转导通路的影响；
（8）本科研小组成员配备合理，对科学孜孜不倦地追求，具有良好的合作精神和奉献精神；
（9）近年来本科研小组参与的研究及成果：详见“3、申请人简历”
参与科研项目：
① 关节炎滑膜细胞G蛋白的功能变化及治疗类风关中药有效部位对其的影响.起止年：2005～2006.安徽省自然科学基金资助项目；
② 白芍总苷对实验性关节炎的滑膜细胞信号转导的影响.起止年：2003～2005,编号：30271606.国家自然科学基金资助项目；
③ 治疗肝炎中药芍芪多苷及其胶囊的研制.起止年：2002～2005；编号：（2002AA2Z3235）.国家863计划项目（中药现代化专项）；
④ 日本血吸虫rSj14-3-3/mAb和rSjGST标准化抗原诊断试剂的研究（2004AA2Z3570）.国家”863”项目；
⑤ 血吸虫14-3-3信号转导及其干预（编号30170841）.国家自然科学基金（已结题 ）。
发表论文：
① Yong-Qiu Zheng, Wei Wei, Xiao-Yi Jia, Lei Zhu. Total glucosides of paeony suppresses adjuvant arthritis in rats and intervenes cytokine-signaling between different types of synoviocytes, Int Immunopharmacol, (accepted)
② 郑咏秋，魏伟.调节类风湿关节炎滑膜细胞基质金属蛋白酶表达的信号转导和相应的药物作用靶点. 中国药理学通报, 2005；21(2):133-137
③ Yong-Qiu Zheng, Wei Wei. Relationship between G proteins-associated transmembrane cascades and MAPK phosphorylation induced by recombinant interleukin-1α in fibroblast-like synoviocytes from rats with adjuvant arthritis (abstract). Acta Pharmacol Sin, 2004; 25 (11): p1541-1543
④ Wei Wei, Yong-Qiu Zheng. Total glucosides of paeony suppressed adjuvant arthritis in rats by intervening G proteins associated transmembrane signal transduction (abstract). Acta Pharmacol Sin, 2004;25 (11): p1562-1564
⑤ Lei Zhu, Wei Wei, Yong-Qiu Zheng, Xiao-Yi Jia. Effects and mechanisms of total glucosides of paeony on joint damage in rat collagen-induced arthritis. Inflammation Res. （accepted）
⑥ 查任远，沈继龙，汪学龙.日本血吸虫重组信号蛋白14-3-3（Sr14-3-3）及其单克隆抗体用于诊断的价值.中国人兽共患病杂志,2004；20（10）：847-849
⑦ 沈际佳，蒋作君，汪学龙，王维，江宝玲.抗童虫表膜单克隆抗体与吡喹酮协同杀血吸虫作用.中国药理学通报，1998；14（5）：440-442
⑧ 李德发，陈月生，祖莹，沈继龙.日本血吸虫DNA疫苗的构建及其保护性免疫.中华预防医学杂志，2004；38（3）：193-195
⑨ 李德发，祖莹，沈继龙.rSj14-3-3 和rSj14-3-3/GST对日本血吸虫虫卵肉芽肿形成的影响.中国人兽共患病杂志,2003;19（5）：55-58
⑩ Shen JL, Chen SG.Cloning, Expression and purification of human 14-3-3 zeta: a marker for the diagnosis of prion diseases.CAB Abstract Veterinary Bulletin,2001；71(4):393-395
2、 工作条件（包括已具备的实验条件，尚缺少的实验条件和拟解决的途径，包括利用国家重点实验室和部门开放实验室的计划与落实情况。）
（1）本室具备寄生虫免疫学和分子生物学研究的基本设备条件，现有：754-紫外分光光度计，PCR扩增仪，紫外分析仪，HYGRA-96 micro-dispenser，超低温冰箱，高速冷冻离心机，超声粉碎仪，全套电泳及蛋白质纯化系统，超纯水系统，CO2孵箱，超净工作台，紫外凝胶成像仪，冷冻干燥机，计算机联网等。
（2）本实验室已和中国科技大学生命科学院中心实验室、中国协和医科大学基础所刘德培实验室建立了良好的协作关系。课题主持人为省基因研究重点实验室副主任，具有良好的研究平台。
（3）本校临床药理研究所为安徽省最早的博士点学科，省和教育厅重点实验室，在中药有效部位及单体研究方面具有雄厚的技术实力和研究条件。
附本实验室部分基本实验设备清单：
仪器设备名称 归属 型号、规格 数量 单 价（￥或＄） 国别、厂家 出厂日期
DNA SequencerMicrodispenserPCR System超纯水系统制冰机CO2孵箱低温层析柜超低温冰箱蛋白电泳分析系统杂交箱UV crosslinker荧光显微镜(正倒置)真空印迹转移仪超净工作台定量荧光DNA扩增仪蛋白质纯化系统高压蒸汽灭菌锅生物安全柜倒置荧光显微镜3.7升小型发酵罐酶标仪 共用本室本室本室本室本室本室本室本室本室本室本室本室本室本室本室本室本室本室本室本室 ABI 377HYGRA-96GeneAmp970E-PUREUBE30-10C-880VREC-2304V1386-3VBio-RadOV4LWNikonVacu-BlotJJT-900SK-2100ABIprims-7000AmershamHIRAYAMAescolecai KLF-2000ELX808U 111111121111111111111 $18万元$1.8万元$2.3万元￥3.9万元￥5.3万元￥6.7万元￥4.9万元￥6.9万元￥3.9万元$0.5$0.3$5.5$0.4￥1.1万元$6.41万元￥ 60万￥6万￥10万￥20万￥25万$1.1万元 USA PEUSA PEUSA PE美国Barnstea德国Ziegra德国美国Revco美国美国Bio-Rad美国、Fisher美国、Fisher日本、Nikon美国、Fisher中国美国瑞典日本新加坡德国瑞士美国 2000年2001年2000年2002年2002年2001年1999年2000年2000年2001年2001年2001年2001年2000年2002年2003年2004年2003年2003年2003年2002年
3、申请人简历（包括申请者和项目组主要成员的学历和研究工作简历，近期已发表与本项目有关的主要论著目录和获得学术奖励情况及在本项目中承担的任务。论著目录要求详细列出所有作者、论著题目、期刊名或出版社名、年、卷（期）、起止页码等；奖励情况也须详细列出全部受奖人员、奖励名称等级、授奖年等。）
（1）沈继龙：教授，博士生导师，1982年于山东医科大学毕业并获硕士学位；1987年赴日本帝京大学研修；1990年毕业并获得中山医科大学博士学位；1996-1998年赴美国CWRU高访学者；长期从事寄生虫学的教学与科研，先后主持国际合作、国家“863”、国家自然科学基金及省部级科研项目10余项，在国内外学术刊物上发表论文100余篇；已获省级、厅级科技成果二、三等奖5项。近年主要从事寄生虫病基因工程疫苗、转基因寄生虫与信号转导的研究。主编、副主编及参加编写专著及教材10部。
发表论文：
① 查任远，沈继龙，汪学龙.日本血吸虫重组信号蛋白14-3-3（Sr14-3-3）及其单克隆抗体用于诊断的价值.中国人兽共患病杂志,2004；20（10）：847-849
② 李德发，祖莹，陈月生，沈继龙.日本血吸虫重组抗原rS14-3-3免疫保护作用的初步研究.中国寄生虫病防治杂志,2004；17（2）：106-108
③ 李德发，陈月生，祖莹，沈继龙.日本血吸虫DNA疫苗的构建及其保护性免疫.中华预防医学杂志，2004；38（3）：193-195
④ 刘庆中，沈继龙.日本血吸虫重组信号蛋白14-3-3 DNA 免疫保护作用的观察.中国人兽共患病杂志.2004；20（3）：47-49
⑤ 李德发，祖莹，沈继龙.rSj14-3-3 和rSj14-3-3/GST对日本血吸虫虫卵肉芽肿形成的影响.中国人兽共患病杂志,2003；19（5）：55-58
⑥ 刘庆中，沈继龙.日本血吸虫重组信号蛋白14-3-3及其DNA疫苗免疫保护性的观察.中国寄生虫学与寄生虫病杂志,2003；21（5）：257-259
⑦ 汪学龙，沈继龙，蒋作君.日本血吸虫Sj14-3-3抗原编码基因的克隆及序列测定.中国人兽共患病杂志，2001；17（5）：45-47
⑧ Shen JL, Chen SG.Cloning, Expression and purification of human 14-3-3 zeta: a marker for the diagnosis of prion diseases.CAB Abstract Veterinary Bulletin,2001；71(4):393-395
⑨ 沈继龙，陈曙光.朊蛋白病诊断标志分子14-3-3 ZETA亚型基因克隆、表达及纯化.中国人兽共患病杂志，2000；16（5）：8-10
（2） 郑咏秋：1991年9月－1995年7月在安徽中医学院药学系学习，获学士学位；1995年7月－2001年3月在安徽中医学院药学系从事教学、科研工作；1997年9月－2001年7月在安徽中医学院药学系中药专业学习，获硕士学位；2001年9月－2005年1月在安徽医科大学临床药理研究所学习，获博士学位。
发表论文：
① Yong-Qiu Zheng, Wei Wei, Xiao-Yi Jia, Lei Zhu. Total glucosides of paeony suppresses adjuvant arthritis in rats and intervenes cytokine-signaling between different types of synoviocytes, Int Immunopharmacol, (accepted)
② 郑咏秋，魏伟.调节类风湿关节炎滑膜细胞基质金属蛋白酶表达的信号转导和相应的药物作用靶点. 中国药理学通报, 2005；21(2):133-137
③郑咏秋，魏伟，戴敏，汪倪萍.木瓜苷抑制小鼠接触性超敏反应及对其胸腺T淋巴细胞亚型的调节作用. 中国药理学通报, 2004；20(9):1016-1020
④Yong-Qiu Zheng, Wei Wei. Relationship between G proteins-associated transmembrane cascades and MAPK phosphorylation induced by recombinant interleukin-1α in fibroblast-like synoviocytes from rats with adjuvant arthritis (abstract). Acta Pharmacol Sin, 2004; 25 (11): p1541-1543
⑤ Wei Wei, Yong-Qiu Zheng. Total glucosides of paeony suppressed adjuvant arthritis in rats by intervening G proteins associated transmembrane signal transduction (abstract). Acta Pharmacol Sin, 2004;25 (11): p1562-1564
⑥ Lei Zhu, Wei Wei, Yong-Qiu Zheng, Xiao-Yi Jia. Effects and mechanisms of total glucosides of paeony on joint damage in rat collagen-induced arthritis. Inflammation Res. （accepted）
（3） 储德勇： 1990年在上海第二医科大学儿科系获学士学位；1995年在安徽省省立儿童医院儿内科工作；2002年在四川成都华西医科大学学习，获医学硕士学位；2004.10-至今在安徽医科大学攻读博士学位。
发表论文：
① 储德勇，李炜如，廖清奎.三磷酸腺苷生物发光法在白血病细胞株K562化疗药物敏感实验中应用探讨.儿科药学杂志，2003；9（6）：7-9
② 储德勇.缺氧缺血性脑损害新生猪海马皮层病理改变及ATP生成率、ATP合成酶活性变化.成都：华西医科大学硕士学位论文，2002
③ 储德勇，李炜如，姚裕家，唐瑟.儿童周围血单个核细胞端粒酶活性检测在诊断急性淋巴细胞白血病中的临床意义.四川医学，2002；23（5）：490-491
（4） 王维： 1987年毕业于安徽医科大学并获学士学位，留校后一直从事寄生虫学教学、科研等工作，现任安徽医科大学病原生物学副教授。主要从事寄生虫分子生物学研究，内容包括基因克隆、DNA重组技术、基因产物的表达及鉴定，并在此基础上进一步研究寄生虫信号传导蛋白与寄生宿主之间的相互作用，旨在寻找寄生虫病新的诊断和候选疫苗分子。
发表论文：
① 王维, 汪学龙, 沈际佳, 蒋作君, 汤中圣.日本血吸虫31/32 KDa 蛋白质基因扩增及克隆.疾病控制杂志,2002；4（4）：302-304
② 李德发，沈继龙，祖莹，王维.日本血吸虫（中国大陆株）信号蛋白14-3-3编码基因重组质粒pET28a-Sj14-3-3的构建和鉴定.热带病与寄生虫学,2001；30（2）：67-69
③ 王维，沈继龙，汪学龙，等：弓形虫14-3-3信号转导蛋白基因的克隆及测序.中国人兽共患病杂志， 2001；17（3）：16-18
④ 沈际佳，蒋作君，余新炳，汪学龙，王维. 日本血吸虫10.6 kDa 膜蛋白基因的克隆及表达.中国寄生虫学与寄生虫病杂志,2001；19（3）：157-159
⑤ 王维,汪学龙.日本血吸虫卵在BLAB/C鼠脾脏异位损害.疾病控制杂志,1999；3（3）：214
⑥ 沈际佳，蒋作君，汪学龙，王维，江宝玲.抗童虫表膜单克隆抗体与吡喹酮协同杀血吸虫作用.中国药理学通报，1998；14（5）：440-442
（5） 胡元生： 1996.7在蚌埠医学院临床医学专业学习； 2002.9 在蚌埠医学院检验系生化与分子生物学教研室工作，安徽医科大学攻读病原生物学专业硕士学位。
发表的论文：
① 胡元生、沈继龙、王学龙、钟政荣、李小月、王家传、倪婧.日本血吸虫酪氨酸羟化酶的体外扩增、克隆和序列分析.中国寄生虫病防治杂志，2005；18（1）：204-206
② 胡元生、沈继龙.日本血吸虫（中国大陆株）14-3-3信号蛋白的体外真核表达（pcDNA3.1（＋））.临床检验与输血杂志,2005；7（1）：4-7
4、承担科研项目情况（申请者和项目组主要成员正在承担的科研项目情况，包括自然科学基金的项目，要注明项目的名称和编号、经费来源、起止年月、负责的内容等。）
①沈继龙，日本血吸虫rSj14-3-3/mAb和rSjGST标准化抗原诊断试剂的研究（编号：2004AA2Z3570）.国家”863”项目,主持人，2004-2005；
②沈继龙，血吸虫14-3-3信号转导及其干预（编号：30170841）.国家自然科学基金,主持人，2002-2004（已结题 ）。
③郑咏秋（参与），白芍总苷对实验性关节炎的滑膜细胞信号转导的影响. 国家自然科学基金资助项目（编号：30271606），2003～2005.该工作本人负责的部分已完成，主要从事有关实验性关节炎滑膜细胞信号转导机制及白芍总苷作用的研究，正准备结题；
④郑咏秋（参与），治疗肝炎中药芍芪多苷及其胶囊的研制（编号：2002AA2Z3235），2002～2005；.国家863计划项目（中药现代化专项）。该工作也已大部分完成，本人主要从事芍芪多苷的分离提取。
5、完成自然科学基金项目情况（对申请者负责的前一个已结题科学基金项目（项目名称及批准号）完成情况、后续研究进展及与本申请项目的关系加以详细说明。另附该已结题项目研究工作总结摘要（限500字）和相关成果的详细目录。）
主持一项国家自然科学基金课题， 名称：血吸虫14-3-3信号转导及其干预；编号：30170841。研究期限：2002-2004。该课题已经完成，并写出结题报告。
中国是受血吸虫病危害最为严重的国家之一.基于近年细胞信号转导研究的有关知识，我们从虫体细胞信号转导通路中寻找中枢性调控分子，以此为靶抗原开发其重组疫苗，以期为寄生虫疫苗筛选提供新思路。根据日本血吸虫信号蛋白14-3-3的核苷酸序列设计引物,扩增编码基因，克隆入原核表达载体pET28a和真核表达载体 pcDNA3.1(+)，表达rSj14-3-3；并制备了抗rSj14-3-3单克隆抗体；用IIF观察了内源性Sj14-3-3在成虫和童虫体内的分布，发现其在虫体内主要定位在皮层、皮下层.14-3-3的蛋白和核酸疫苗具有较好的免疫保护效果：IFA证实重组真核表达质粒在局部肌细胞有表达的荧光信号；疫苗减虫率在32%-41.3%之间；减卵率在52%-60%之间；疫苗接种后血清抗体水平明显升高；肝脏虫卵肉芽肿直径明显缩小（178.12±32.18减小至275.00±38.21）;每克肝组织虫卵数减少了52.6%；以IL-2为佐剂免疫小鼠，T亚群增高，Th1和Th2细胞因子检测结果为IFN-r和IL-4水平升高，CD4/CD8下降。用重组Sj14-3-3抗原诊断急、慢性患者具有高度的特异性、敏感性。进一步开发rSj14-3-3 和 GST标准化免疫诊断试剂的研制获得了国家863计划资助，项目正在紧张进行中。
该项基金已完成并结题。共发表研究论文23篇，其中核心期刊14篇；参加国际会议并大会报告3次；培养研究生4人，青年教师4人。由该基金项目的研究成果，继续获得国家“863”课题一项。
已经完成结题的国家自然科学基金课题发表的论文目录：
序号 成果类型 成果或论文名称 主要完成者 成果说明 标注状况
1 期刊论文 日本血吸虫重组信号蛋白14-3-3的纯化及抗体制备 李锋，胡敏，沈继龙 中国寄生虫学与寄生虫病杂志2003；21（4）：221 标注
2 期刊论文 日本血吸虫重组信号蛋白14 3 3疫苗免疫保护性的观察 刘庆中，沈继龙 中国寄生虫学与寄生虫病杂志，2003；21（5）：257-260 标注
3 期刊论文 日本血吸虫DNA疫苗的构建及其保护性免疫 李德发，沈继龙 中华预防医学杂志，2004；38（3）：1 标注资助PubMed
4 期刊论文 日本血吸虫信号蛋白14 3 3的虫体免疫定位 刘庆中，沈继龙，汪学龙 中国寄生虫学与寄生虫病杂志2003；21（6）:330-332 标注资助PubMed
5 期刊论文 rSj14-3-3和rSj14-3-3/SjGST对日本血吸虫虫卵肉芽肿形成的影响 李德发，沈继龙 中国人兽共患病杂志，2003；19（5）：55 标注资助
6 期刊论文 日本血吸虫重组信号蛋白14-3-3(rSj14-3-3)及其单克隆抗体用于诊断的价值 查任远，沈继龙 中国人兽共患病杂志，2004；20（10）847 标注资助
7 期刊论文 两种血吸虫病疫苗候选分子在原核细胞的融合表达 沈继龙，祖莹 中国寄生虫病防治杂志，2003； 16（1）：4 标注资助
8 期刊论文 日本血吸虫（中国大陆株）信号蛋白14-3-3在原核细胞内的高效融合表达特性鉴定。 李德发，沈继龙 中国人兽共患病杂志，18（2）：50 标注资助
9 期刊论文 日本血吸虫信号蛋白编码基因表达质粒的构建。 李德发，沈继龙 中国寄生虫学与寄生虫病杂志。2002；20（2）：123 标注资助
10 期刊论文 重组日本血吸虫14-3-3蛋白的纯化和免疫特性分析 李德发，沈继龙 蚌埠医学院学报，2003; 28（1）:1 标注资助
11 期刊论文 血吸虫的细胞跨膜信号转导 刘庆中，沈继龙 国外医学寄生虫病分册, 2002；29（5）：199 标注资助
12 期刊论文 日本血吸虫14-3-3抗原编码基因的克隆及序列测定 汪学龙，沈继龙，蒋作君 中国人兽共患病杂志, 2001；17（5）：45 标注资助
13 期刊论文 日本血吸虫大陆株14-3-3信号转导蛋白epsilon亚型基因的表达及鉴定 唐小牛，汪学龙，沈继龙 中国寄生虫病防治杂志2003；16（6）：358 标注资助
14 期刊论文 日本血吸虫重组信号蛋白14-3-3DNA免疫保护作用的观察 刘庆中，沈继龙 中国人兽共患病杂志，2004；20（3）：230 标注资助
15 期刊论文 日本血吸虫(中国大陆株)14-3-3信号转导蛋白ｅｐｓｉｌｏｎ亚型基因真核表达重组质粒的构建及序列分析 唐小牛，汪学龙，沈继龙 中国人兽共患病杂志，2004；20（3）：220 标注资助
16 期刊论文 日本血吸虫重组信号蛋白14-3-3对日本血吸虫病的诊断价值 刘庆中，沈继龙，汪学龙 安徽医科大学学报，2003；38（4）：252 标注资助
17 期刊论文 日本血吸虫重组抗原rSj14-3-3免疫保护作用的初步研究 李德发，沈继龙 中国寄生虫病防治杂志，2004；17（2）：106 标注资助
18 期刊论文 14 3 3蛋白与凋亡 钟政荣，沈继龙 国外医学·生理、病理科学与临床分册2004；24（5） 标注资助
19 期刊论文 日本血吸虫（中国大陆株）信号蛋白14-3-3编码基因重组质粒pET28a-Sj14-3-3的构建和鉴定 李德发，沈继龙 热带病与寄生虫学, 2001；30（2）：67 标注资助
20 期刊论文 血吸虫核酸疫苗研究进展 李德发，沈继龙 国外医学寄生虫病分册2002；29（5）：199 标注资助
21 期刊论文 抗rSj14-3-3单克隆抗体检测循环抗原及疗效考核价值的初步研究 查任远，沈继龙，汪学龙 安徽医科大学学报2004；39（3）：204 标注资助
22 期刊论文 日本血吸虫信号转导分子14-3-3蛋白epsilon亚型基因的克隆与序列分析 汪学龙，沈继龙，蒋作君 中国地方病学杂志, 2002；21（4）：254 未
23 期刊论文 日本血吸虫（大陆株）14-3-3epsilon信号转导蛋白诱导小鼠保护性免疫的研究 唐小牛，汪学龙，沈继龙 中国血吸虫病防治杂志, 2002；14（3）：76 未
1 会议论文 Immunoprotection and diagnostic potential of signaling protein 14-3-3 of S. japonicum 沈继龙 International Symposium- Research for sustainable control of schistosomiasis(Heidelberg,Germany,2003) 国际会议大会报告
2 会议论文 Impact of environmental changes and schistosomiasis transmission in Yangtze River following the construction of Three-gorges Dam. 沈继龙 The role of services in crisis prevention and conflict resolution.(Heidelberg, Germany,2003) 国际会议大会报告
3 会议论文 Cloning and expression of two isoforms of 14-3-3 protein of Schistosoma japonicum (Chinese mainland starin) 沈继龙 International Symposium on Schistosomiasis.(Wuhan, 2004) 国际会议大会报告
4 会议论文 日本血吸虫信号蛋白14-3-3的免疫保护作用研究。 沈继龙,刘庆中 中华预防医学会第五次全国医学寄生虫学术会议论文（上海，2003） 全国会议分组报告
（三）经费申请说明（要求按照《国家自然科学基金经费管理办法》认真填写，购置5万元以上固定资产及设备等，须逐项说明与项目研究的直接相关性及必要性。）
1. 本研究申请的所有经费将按照《国家自然科学基金经费管理办法》范围开支；
2. 本校文件规定，课题结题时，必须进行经费审计；
3. 课题经费不用于购买万元以上的大型仪器设备，不用于大的实验室改装；
4. 依托单位文件承诺：将按照申请资助经费的1：1匹配。
（四）其他附件清单（附件材料复印后随纸质《申请书》一并上交）
（随纸质申请书一同报送的附件清单，如：具有中级技术职称申请者的推荐信或在职研究生申请项目的导师推荐信等。在导师的推荐信中，需要说明申请课题与学位论文的关系，承担课题后的工作时间和条件保证等。）
无
